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Estrazione del DNA, amplificazione e sequenziamento del gene 16S rRNA
Il DNA totale viene estratto da campioni di diverse matrici (fecale, urinaria, orale e vaginale) utilizzando un kit commerciali della ditta QIAGEN (Hilden, Germany, DNeasy Blood & Tissue Kit) con una modifica iniziale al protocollo. Il materiale viene aggiunto a 4 biglie di vetro da 3mm e 0.5g di biglie di zirconia da 0.1 mm (BioSpec Products, Bartlesville, OK, USA), successivamente vengono eseguiti tre step di omogeneizzazione mediante l’uso dello strumento FastPrep (MP Biomedicals, Irvine, CA, USA) a 5.5 m/s per 1 minuto. Infine, i campioni vengono incubati a 95 °C per 15 minuti, così da eseguire sia una rottura meccanica che da shock termico. Il DNA così estratto viene conservato a -20 °C per le successive analisi. La quantifica del DNA estratto viene eseguita mediante l’utilizzo di uno spettrofotometro NanoDrop ND1000 (NanoDrop Technologies, Wilmington, DEU), che ne consente la successiva diluizione alla concentrazione di lavoro.
La successiva preparazione delle librerie di sequenziamento viene eseguita seguendo il protocollo Illumina 16S Metagenomic Sequencing Library Preparation (Illumina, San Diego, CA, USA). Nello specifico le regioni ipervariabili V3-V4 del gene 16S rRNA vengono amplificate tramite reazione di PCR in un volume finale di 50 μL contenente DNA genomico (25 ng), 2X KAPA HiFi HotStart ReadyMix (Roche, Basilea, Svizzera) e 200 nmol/L dei primer 341F e 785R, portatori delle sequenze adattatrici Illumina.
Il ciclo termico della PCR prevede una denaturazione iniziale (95 °C per 3 min), seguita da 25 cicli di denaturazione (95 °C per 30 s), annealing dei primer (55 °C per 30 s) ed estensione del DNA (72 °C per 30 s), la reazione si conclude con un’estensione finale a 72 °C per 5 min.
I prodotti di PCR così ottenuti vengono purificati mediante Agencourt AMPure XP magnetic beads (Beckman Coulter, Brea, CA, USA). Le librerie indicizzate vengono successivamente preparate tramite PCR a ciclo limitato utilizzando la tecnologia Nextera e purificate come sopra tramite l’utilizzo di beads magnetiche. Le librerie vengono poi quantificate tramite l’utilizzo di un fluorimetro Qubit 3.0 (Invitrogen, Waltham, Massachusetts, USA), normalizzate a una concentrazione di 4 nM e unite in un unico tubo Eppendorf. Il pool di librerie viene quindi denaturato con NaOH 0,2 N e diluito fino a una concentrazione finale di 5.5 pM con un controllo PhiX al 20%.
Il sequenziamento finale viene poi eseguito su piattaforma Illumina MiSeq con protocollo paired-end 2 × 250 bp o 2 x 300 bp, seguendo le istruzioni del produttore (Illumina, San Diego, CA, USA).
Metabarcoding: bioinformatica e biostatistica
Le sequenze grezze ottenute dal sequenziatore vengono analizzate mediante una pipeline che combina PANDAseq (Masella et al., 2012) e QIIME 2 (Bolyen et al., 2019). Le letture di alta qualità (lunghezza minima/massima = 350/550 bp) vengono ottenute usando la funzione fastq filter dell’algoritmo Usearch11 (Edgar 2010) e quindi successivamente raggruppate in ASV (Amplicon Sequence Variants) tramite DADA2 (Callahan et al., 2016). La classificazione tassonomica viene eseguita mediante l’utilizzo dell’algoritmo VSEARCH (Rognes et al., 2016) e il database SILVA (Quast et al., 2013). Tutte le sequenze non assegnate vengono infine scartate.
La diversità alfa viene calcolata utilizzando la metrica dell’indice di Shannon, infine le analisi e la produzione dei grafici vengono eseguite in R e Python.
Sequenziamento shotgun metagenomico
Il DNA estratto e congelato ottenuto tramite i metodi di estrazione sopra descritti, viene utilizzato anche per l’esecuzione del sequenziamento shotgun metagenomico, che consente di sequenziare in maniera massiva tutto il metagenoma del campione. La preparazione delle librerie di DNA per il sequenziamento shotgun viene eseguita con il QIAseq FX DNA library kit (QIAGEN) secondo le istruzioni del produttore.
Nello specifico 100 ng di DNA totale per ciascun campione vengono frammentati in frammenti di DNA di 450 bp, con estremità riparate e code A, utilizzando il mix enzimatico FX (contenuto all’interno del kit) e il seguente ciclo termico: 4 °C per 1 min, 32 °C per 8 min e 65 °C per 30 min. Le librerie vengono poi incubate a 20 °C per 15 min per la ligazione degli adattatori Illumina in presenza di DNA ligasi e successivamente avviene la purificazione dei prodotti tramite Agencourt AMPure XP beads, seguita da un’amplificazione PCR di 10 cicli e da un’ulteriore purificazione con beads magnetiche. I campioni vengono quindi miscelati in concentrazioni equimolari (4 nM) per ottenere la libreria finale. Il sequenziamento viene poi eseguito su piattaforma Illumina NextSeq con protocollo paired-end 2 × 150 bp, seguendo le istruzioni del produttore.
Metagenomica: bioinformatica e biostatistica
Le letture grezze ottenute dal sequenziatore, vengono processate per rimuovere le letture derivanti dal DNA eucariotico dell’ospite utilizzando KneadData e come riferimento il genoma dell’ospite ottenuto dalla reference depositata su NCBI GenBank. In seguito al filtraggio, le letture vengono processate mediante l’utilizzo di fastp per eseguire la rimozione di letture corte e di scarsa qualità, e per la rimozione di duplicati. Le letture di alta qualità risultanti vengono utilizzate per l’assegnazione tassonomica mediante approcci basati sui k-mer (Kraken2 e il database di riferimento Kraken2 Standard) e per l’assegnazione funzionale tramite pipeline che consentono la profilazione accurata della presenza/assenza e abbondanza di pathways batterici nelle comunità batteriche (HUMAnN).